K8·凯发(中国)

针对上述问题，北京大学深圳医院口腔医学中心杨宏宇、中国科研院深圳先进技术研究院耿胜勇团队研究开发了一种光热响应型多功能MnO₂纳米酶，以促进口腔鳞状细胞癌（OSCC）中的铁死亡。将FDA批准的铁死亡诱导剂RSL3包裹在中空介孔MnO₂纳米颗粒（HM-MnO₂）内，并用铁掺杂多巴胺（Fe-PDA）和cRGD肿瘤靶向肽进行修饰。该MnO₂-RSL3@FePDA-cRGD纳米催化系统在靶向递送至肿瘤部位后，模拟过氧化物酶（POD）、氧化酶（OXD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和NADH氧化酶（NOx）的多酶活性，顺利获得产生大量ROS和有效消耗GSH，为铁死亡创造最佳TME。在808 nm激光照射下，PDA介导的光热效应导致系统迅速降解并释放RSL3，随后引发的级联反应触发强大的铁死亡，并与光热疗法协同作用抑制肿瘤生长。这种创新策略为增强铁死亡、提高抗肿瘤治疗效果给予了一种有前景的方法(图1)。相关研究在2025年6月15日以“A photothermal-responsive multi-enzyme nanoprobe for ROS amplification and glutathione depletion to enhance ferroptosis”为题发表于《Biosensors and Bioelectronics》（DOI: 10.1016/j.bios.2025.117384）上。

图1. MnO₂-RSL3@FePDA-cRGD (MnO₂R@FePDAc)纳米催化体系的构建及顺利获得多酶模拟活性实现光热驱动的铁死亡

（1）MnO 2 R@ FePDAc纳米催化体系的合成与表征

采用模板法合成中空介孔MnO₂（HM-MnO₂），透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）图像确认其具有明确表面形貌的中空介孔结构（图2a）。根据比表面积分析（BET）结果，HM-MnO₂纳米颗粒比表面积为33.0 m²/g，平均孔径为3.5 nm，具备高效纳米载体所需的高比表面积和介孔特性（图2b）。将铁死亡诱导剂RSL3载入HM-MnO₂内核后，在表面组装铁掺杂多巴胺（Fe-PDA），随后用cRGD肿瘤靶向肽进行功能化修饰，采用差速离心法去除未结合的小PDA颗粒和cRGD。如图2c所示，最终产物MnO₂-RSL3@FePDA-cRGD（记作MnO₂R@FePDAc）保持约150 nm平均直径的中空球形结构。能量色散X射线光谱（EDS）映射显示Mn和Fe元素显著存在，且含有C、N、O、S、Cl元素（图2d）。X射线衍射（XRD）图谱（图2e）在36.7°和66.3°处有归属于晶态MnO₂的明显峰，20-30°的宽峰对应PDA。X射线光电子能谱（XPS）用于确定MnO₂R@FePDAc表面元素组成和化学态（图2f），其光谱在652.5 eV和640.8 eV处的结合能峰分别对应Mn 2p₁/₂和Mn 2p₃/₂，经峰拟合得到Mn⁴⁺ 2p₁/₂和Mn⁴⁺ 2p₃/₂信号，证实Mn主要以Mn⁴⁺氧化态存在（图2g）；Fe 2p₁/₂ XPS峰位于723.5 eV和716.7 eV，分别归属于Fe³⁺和Fe²⁺，Fe 2p₃/₂峰位于712.2 eV和710.0 eV，进一步证实Fe³⁺和Fe²⁺共存，确定了Mn和Fe的价态（图2h）。此外，傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析证实PDA和cRGD成功修饰于表面（图2i），596 cm⁻¹处的FT-IR峰归因于Fe-O伸缩振动，表明在HM-MnO₂表面形成了Fe-PDA聚合物。这些结果证实了MnO₂R@FePDAc纳米催化系统的成功制备。

图2. MnO₂R@FePDAc的表征。(a) HM-MnO₂的 TEM 图像。(b) HM-MnO₂的 N₂吸附-解吸等温线和孔径分布曲线。(c) MnO₂R@FePDAc的 TEM 图像和 (d) EDS 映射。(e) MnO₂纳米粒子和 MnO₂R@FePDAc的 XRD 图案比较。(f) 全范围 XPS 光谱和 (g) Mn 2p 和 (h) Fe 2p 相应的高分辨率 XPS 光谱。 (i) FT-IR 光谱

（2）MnO₂R@FePDAc的光热性能

MnO₂R@FePDAc的紫外-可见-近红外光谱在近红外区有显著吸收。利用红外热成像相机监测不同浓度纳米颗粒悬浮液在1.0 W/cm²的808 nm激光照射下的温度变化，如图3a所示，与磷酸盐缓冲液（PBS）对照组相比，MnO₂R@FePDAc溶液温度呈浓度依赖性上升，表明其能有效将激光能量转化为热能。光热性能呈功率密度依赖性，且经五次加热冷却循环后无温度衰减（图3b），具有光热稳定性。计算得到的光热转换效率为39.1%（图3c），足以增强催化性能和降解能力，而未掺杂的PDA光热转换效率为24.0%，铁掺杂显著提升了光热性能，促进PDA中的非辐射弛豫，诱导铁死亡。鉴于其光热性能，研究了MnO₂R@FePDAc的药物控释行为和降解情况。280 nm处的吸收峰证实了RSL3成功载入MnO₂R@FePDAc（图3d）。在模拟肿瘤微环境（TME）条件下（pH = 5.4，含10 mM GSH和100 μM H₂O₂），MnO₂R@FePDAc对RSL3呈缓慢释放，而近红外光照射则触发药物快速大量释放（图3e）。顺利获得评估有无近红外光照射下MnO₂R@FePDAc的过氧化物酶（POD）活性，来研究近红外光照射对催化能力的影响，经近红外光处理后，因氧化TMB导致的652 nm处吸光度显著增强（图3f），表明光热效应显著提升了MnO₂R@FePDAc的催化性能。进一步顺利获得观察形态变化来探究MnO₂R@FePDAc的近红外光响应性药物释放机制，在pH 7.4的生理条件下，MnO₂R@FePDAc结构稳定（图3g）；在模拟TME条件下孵育1小时后，纳米颗粒结构部分降解（图3h）；而在模拟TME条件下经10分钟近红外光照射后，MnO₂R@FePDAc完全降解（图3i）。这些结果表明，光热效应的引入加速了药物释放，显著增强了MnO₂R@FePDAc的催化活性，有助于营造促进铁死亡的最佳肿瘤微环境。

图3.MnO₂R@FePDAc的光热特性。（a）1.0 W/cm²近红外光照射下的温度变化曲线。（b）五次开关循环（100 μg/mL）内的光热稳定性。（c）光热转换效率：红线表示光热效应；紫线表示在冷却期间确定的时间常数（τs）。（d）紫外可见光吸收光谱。（e）在模拟 TME 条件（pH = 5.4，10 mM GSH和100 μM H₂O₂）下，有或没有近红外光照射（1.0 W/cm 2 ，持续10分钟）时 RSL3 的释放行为。（f）oxTMB在652 nm处的吸光度表明具有 POD 样活性。（g-i）MnO₂R@FePDAc分别在pH 7.4下与10 mM GSH 孵育1小时、模拟TME 条件以及在模拟TME条件下近红外辐射10分钟后的 TEM 图像

（3）酶活性检测

MnO₂R@FePDAc的多酶模拟特性对增强活性氧（ROS）生成和谷胱甘肽（GSH）消耗至关重要。其过氧化物酶（POD）活性顺利获得3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）作为底物进行评估，TMB被氧化后在652 nm处有特征吸收峰。其对TMB的米氏常数（Km）为0.011 mM，最大反应速率（Vmax）为2.136×10⁻⁷ M s⁻¹，远优于Fe-PDA（图4a）。其氧化酶（OXD）活性在TMB底物下进行评估，Km为0.059 mM，Vmax为3.453×10⁻⁷ M s⁻¹，催化效率显著高于Fe-PDA（图4b）。在模拟肿瘤微环境（TME）条件下，MnO₂R@FePDAc对GSH的Km和Vmax值分别为0.24 mM和1.657×10⁻⁹ M s⁻¹，远高于Fe-PDA（图4c）。其NADH氧化酶（NOx）活性顺利获得与2 mM NADH在pH 4.5、37℃下反应30分钟进行评估，其Km和Vmax值分别为0.15 mM和1.455×10⁻⁶ M s⁻¹，显著优于Fe-PDA（图4d）。这些结果突出了MnO₂R@FePDAc的多酶模拟作用，包括 POD、OXD、GPx 和 NOx 活性（图4e），凸显了其在诱导肿瘤细胞铁死亡爆发方面的巨大潜力。电子自旋共振（ESR）光谱检测到MnO₂R@FePDAc在pH 5.4时能产生羟基（•OH）和超氧（O₂•⁻）自由基，且在加入H₂O₂后，•OH和O₂•⁻信号显著增强（图4f和图4g）。在近红外（NIR）光照射下，MnO₂R@FePDAc催化H₂O₂产生ROS的反应速率加快，ROS生成量增加（图4h）。

图4.与MnO2R@FePDAc相关的酶动力学。(a)类POD、(b)类OXD、(c)类GPx和(d)类NOx活性的Michaelis-Menten曲线。(e)多酶模拟活性示意图。(f)检测•OH和(g)O2•−的ESR光谱。(h)与100 μM H2O2和2 mM TMB反应5分钟后在652 nm处的吸光度

（4）体外铁死亡机制

MnO₂R@FePDAc对口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞的铁死亡介导细胞死亡效率及机制如下：IR-780修饰的MnO₂R@FePDAc在HN6细胞中孵育6小时后，细胞核周围出现密集红色荧光（图5a），表明其可被肿瘤细胞高效内化。100 μg/mL HM-MnO₂处理细胞24小时，存活率仍高于90%（图5b），具有良好的生物相容性。与对照组相比，NIR照射下细胞存活率接近100%，光毒性小（图5c）。40 μg/mL的MnO₂R@FePDAc处理使细胞存活率下降31.8%，NIR照射下95.2%的细胞被杀死（图5c），归因于光热激活的铁死亡爆炸。活/死细胞染色显示MnO₂R@FePDAc + NIR组完全呈现红色荧光（图5d），与细胞存活率结果一致。MnO₂R@FePDAc在肿瘤微环境（TME）条件下模拟多酶活性，光热响应性释放RSL3，为诱导铁死亡爆炸奠定基础。经MnO₂R@FePDAc和NIR照射处理的细胞，在模拟TME条件下产生显著的活性氧（ROS）（图5e），且脂质过氧化（LPO）水平最显著（图5f）。MnO₂R@FePDAc处理显著增加丙二醛（MDA）水平，与NIR联合处理时MDA水平进一步升高（图5g）。MnO₂R@FePDAc + NIR处理的HN6细胞中相对谷胱甘肽（GSH）水平下降75%（图5h），表明其有效消耗GSH。MnO₂R@FePDAc + NIR组NADH水平显著下降（图5j），可抑制GSH产生。经MnO₂R@FePDAc处理的HN6细胞的透射电子显微镜（TEM）图像显示铁死亡诱导的线粒体功能障碍特征（图5i）。Western blot分析显示，谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）表达显著下调，铁死亡抑制蛋白1（FSP1）、铁蛋白重链1（FTH1）、铁氧还蛋白1（FDX1）等铁死亡相关蛋白表达被抑制（图5k）。

图5.体外抗肿瘤活性和机制。（a）用IR-780标记的MnO2R@FePDAc 处理6小时后的CLSM图像。（b）与游离HM-MnO2孵育24 小时后的相对细胞活力。（c）不同处理后的相对细胞活力。（d）指示活（绿色）/死（红色）细胞的荧光图像。（e）细胞 ROS（绿色）/核（蓝色）的荧光图像。（f）使用 Liperfluo 探针的细胞 LPO 含量的荧光图像。（g）顺利获得商业试剂盒检测HN6细胞的 MDA、（h）GSH和（j）NADH 含量。（i）经过不同预处理的HN6细胞的 Bio-TEM 图像。（k）不同处理24小时后GPX4、FSP1、FTH1和FDX1表达的Western印迹分析（ⅰ.对照组，ⅱ. NIR组，ⅲ. MnO2R@FePDAc组，ⅳ. MnO2R@FePDAc + NIR组）。NIR组：808 nm激光以0.5 W/cm2的功率照射5分钟

（5）体内荧光成像及抗肿瘤功效

在HN6肿瘤小鼠中，MnO₂R@FePDAc的荧光成像显示其在肿瘤部位的荧光信号于注射后48小时达到峰值，随后下降（图6a），这归因于EPR效应和cRGD介导的靶向能力。在0.5 W/cm²的NIR照射下，肿瘤部位温度在5分钟内升至48.2℃（图6b和c），表明其具有优越的光热效果，可增强ROS生成和铁死亡。在体内抗肿瘤效果方面，MnO₂R@FePDAc诱导的铁死亡有效抑制肿瘤生长，MnO₂R@FePDAc + NIR组实现肿瘤生长完全抑制甚至消融（图6d和e），且肿瘤重量显著低于其他组（图6f）。组织病理学分析（图6g）和免疫荧光检测（图6h）进一步证实了其优越的抗肿瘤效果和协同铁死亡效应，同时各组间体重无显著差异，表明良好的生物相容性。

图6.体内抗肿瘤活性。（a）注射IR-780标记的MnO2R@FePDAc 后不同时间点的全身光学活体成像，以及注射后 48 小时的体外荧光成像。（b）注射后48小时在0.5 W/cm2的近红外辐射下对肿瘤部位进行红外热成像。（c）图5b中肿瘤部位的温度变化。（d）不同组的肿瘤生长曲线。（e）治疗结束时的肿瘤照片。（f）肿瘤重量。（g）肿瘤组织的H&E染色、TUNEL检测和Ki67免疫荧光染色。（h）FTH1、GPX4和FDX1 的免疫荧光染色