K8·凯发(中国)

图1. 特洛伊木马仿生PDMI纳米颗粒的构建与治疗功能示意图。

（1）PDMI的合成与表征

顺利获得可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合成功合成了三元嵌段共聚物P(PBA-bDMA-bMPC)（简称PDM），并顺利获得苯基硼酸与黄酮类化合物ICA的酯化反应制备了载药聚合物PDMI。PDM的¹H NMR谱图显示了苯环质子信号（PBA: δ = 7.56, 7.44 ppm; DMA: δ = 6.87, 6.72 ppm）以及MPC的特征峰（亚甲基：δ = 4.18–4.06 ppm，甲基：δ = 3.51, 3.08 ppm），证实了嵌段结构的完整性。FTIR光谱显示ICA偶联后在约3400 cm⁻¹处出现增强的宽吸收带。XPS进一步阐明了接枝过程的化学机制：N 1s谱揭示了MPC中季铵氮（-N(CH₃)₃⁺, 402.5 eV）和酰胺氮（-CONH-, 399.6 eV）的存在；P 2p峰（133.5 eV）证实了核心聚合物结构保持完整；B 1s结合能从190.8 eV增加至191.4 eV，归因于硼酸基团与ICA形成硼酸酯键。TEM图像显示PDM和PDMI均呈球形、形貌均一且具有良好的单分散性。DLS测量表明ICA接枝后平均水合粒径从226.93 nm增加至440.77 nm。PDMI在pH 5.5、6.5和7.4条件下均保持窄粒径分布，表现出良好的胶体稳定性。

图2. PDMI的合成与表征。(a) PDMI的合成路线。(b) PDMI自组装示意图。(c) 三元聚合物PDM的¹H NMR谱图。(d) FTIR光谱。(e) PDMI的XPS全谱。(f-h) N 1s、P 2p和B 1s的高分辨窄谱。(i) PDM和PDMI的代表性TEM图像。(j) PDM和PDMI的粒径分布。(k) PDM和PDMI的Zeta电位分布。

（2）ROS响应释药行为与ROS清除效率

PDMI的抗炎功能体现在两个方面：第一时间，DMA的儿茶酚结构作为"守门人"，顺利获得与PTOA微环境中产生的ROS反应并被氧化为醌，发挥被动抗炎作用；其次，PBA与ICA形成的苯基硼酸酯键如同"盾牌"，在ROS作用下发生裂解，同时释放作为"士兵"的药物ICA，实现主动抗炎功能。药物接枝效率经UV-Vis测定为67.47%，高于非共价载药系统（通常20–30%）。在模拟炎症释放介质中，无ROS时ICA几乎不释放（48 h约14%），而在含H₂O₂介质中，ICA在约8 h的滞后相后触发释放，48 h内累积释放接近100%，且释放速率随H₂O₂浓度升高而增加。¹H NMR和GPC进一步证实ICA特征峰消失且聚合物链分子量略有降低，表明释放过程中发生了键断裂。顺利获得NBT、DPPH和ABTS三种方法评估了PDMI的自由基清除能力：PDMI对超氧阴离子（O₂·⁻）的清除效率在1.5 mg/mL时达86%，优于未载药系统PDM（72%）；对DPPH·和ABTS·⁺的清除效率在1.0 mg/mL和1.5 mg/mL时分别超过90%和约95%。

图3. PDMI的ROS响应释药行为与ROS清除效率表征。(a) PDMI与ROS发生化学反应实现被动抗炎与主动抗炎的化学方程式。(b) ROS响应释药机制示意图及PDMI和RPDMI的代表性TEM图像。(c) PDMI和RPDMI的粒径分布。(d) ICA在PBS中不同浓度下的吸光度标准曲线。(e) 不同条件下的累积释药曲线。(f) ROS响应前后PDMI的¹H NMR谱图。(g) ROS响应前后PDMI的GPC谱图。(h-i) NBT法测定PDM的UV-vis吸收光谱和清除效率。(j-k) NBT法测定PDMI的UV-vis吸收光谱和清除效率。(l-m) ABTS法和DPPH法测定PDMI的清除效率。

（3）润滑性能评价

为评估PDMI在更接近复杂关节环境中的润滑性能，采用UMT在含蛋白质和透明质酸的模拟滑液中进行摩擦学测试。PDMI在所有测试条件下均降低了摩擦系数（COF），在3 N和3 Hz下COF从0.1013降至0.0485，降幅约52.07%。为进一步阐明微尺度润滑行为，采用AFM进行纳米摩擦学测试。与前期研究相比，本工作开发的PDMI表现出低于0.01的COF，在1.0 mg/mL和1 Hz时COF低至0.00769，较水对照组降低超过70%。随着PDMI浓度增加，COF单调递减，这归因于MPC中两性离子磷酰胆碱基团顺利获得静电-偶极相互作用捕获并有序取向自由水分子，形成水合润滑层。即使在3 Hz下，PDMI仍实现了0.001量级的COF，表明在测试条件下达到了超润滑状态。考察ROS触发释药后的RPDMI润滑行为发现，释药后COF略有上升，但仍低于纯水，因为ROS裂解仅去除药物侧链而保留了聚合物骨架，剩余的两亲性链仍能自组装成稳定纳米颗粒并顺利获得水合与滚动润滑协同效应维持低摩擦保护。

图4. PDMI和RPDMI的润滑性能表征。(a)-(c) 不同滑动频率下含或不含PDMI的模拟滑液摩擦曲线。(d)-(f) 含或不含PDMI的模拟滑液COF定量比较。(g) 纳米摩擦学测试实验装置示意图。(h) 本工作与前期研究的COF值比较。(i)-(k) AFM测试不同浓度和频率下PDMI的COF定量比较。(l)-(n) AFM测试不同浓度和频率下RPDMI的COF定量比较。

（4）生物相容性、软骨细胞摄取与免疫逃逸

CCK-8实验显示，当PDMI浓度低于400 μg/mL时，原代软骨细胞和RAW264.7巨噬细胞在孵育72 h后存活率仍高于98%。大鼠全血溶血实验及Live/dead染色进一步证明PMI、PDM和PDMI均具有优异的生物相容性。软骨细胞摄取实验表明，与对照组相比，PDM和PDMI均表现出增强的细胞内化，PDMI的摄取效率最高，这与其粒径、表面电位、疏水性和聚合物链排列变化促进膜接触和内吞有关。巨噬细胞作为免疫系统的关键吞噬细胞，通常介导外源物质的快速清除。MPC是细胞膜的主要成分，可防止PDMI被巨噬细胞识别吞噬。CLSM和FCM追踪显示，巨噬细胞在最初24 h内持续内化PDMI，但24 h后胞内荧光逐渐降低。双荧光（FITC和maleimide-Cy5）共定位分析表明，胞内荧光主要与结构完整的PDMI相关，而非游离染料或降解片段。外排抑制剂GW4869处理显著减少上清液荧光并增强胞内滞留，且不影响细胞活力，支持囊泡介导的主动外排过程。TEM观察进一步证实，培养上清中分离的囊泡样结构内包裹有纳米颗粒样物质，其形态和电子密度与PDMI一致。C3调理实验表明，抑制PDMI表面C3沉积可减少巨噬细胞摄取，支持补体介导的识别参与其免疫清除。

图5. PDMI的生物相容性、软骨细胞摄取与免疫逃逸表征。(a) 不同浓度PDMI培养软骨细胞的细胞活力。(b) 不同浓度PDMI孵育巨噬细胞的细胞活力。(c) PDMI孵育后的全血溶血实验。(d) 与PMI、PDM和PDMI孵育8 h后软骨细胞的代表性CLSM图像。FITC：荧光素O-甲基丙烯酸酯。(e) 与PMI、PDM和PDMI培养8 h的软骨细胞FCM分析。(f) FCM检测不同组软骨细胞摄取的定量分析。MFI：平均荧光强度。(g) PDMI与巨噬细胞孵育48 h用于免疫逃逸评估的代表性CLSM图像。(h) FCM检测不同组巨噬细胞摄取的定量分析。(i) RAW264.7内化PDMI后胞内和上清液FITC荧光强度随时间的变化。(j) 外排抑制剂GW4869对RAW264.7胞内和上清液FITC荧光强度的影响。(k) GW4869处理对RAW264.7活力的影响。

（5）PDMI抗炎效应的生物学机制

为探究PDMI对软骨细胞功能的调控作用，对LPS处理的软骨细胞进行RNA测序和差异表达基因（DEGs）分析。热图显示，与LPS组相比，PDMI下调了关键炎症和线粒体氧化应激相关基因（如Ccl20、Chdh、Il13ra2），同时上调了与代谢和ECM合成相关的关键基因（如Bmp2、Efemp1、Itgbl1）。火山图和MA图共鉴定出218个显著上调和156个显著下调基因。PCA显示LPS组与PDMI组之间存在显著分离。GO富集分析显示DEGs富集于结缔组织发育、炎症或应激反应等过程；KEGG分析突出显示ECM合成和炎症代谢相关通路，包括TGF-beta信号通路和ECM-受体相互作用。Western blot进一步验证了这些分子变化：氧化应激刺激使NRF2表达降至对照组的约15.86%，p-P65/P65和p-IκBα/IκBα比值分别增加约5.16倍和10.76倍；PDMI处理使NRF2表达恢复至对照组的约61.27%，并将两个磷酸化比值分别降低约35.47%和42.04%，表明激活了NRF2介导的抗氧化防御并抑制了NF-κB/IκBα信号通路。RT-qPCR进一步证实，PDMI分别将TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达水平降低约40.43%、59.54%和37.71%。

图6. PDMI发挥抗炎效应的生物学机制。(a) DEGs热图。(b) 火山图。(c) PCA图。(d) DEGs的GO富集分析。(e) DEGs的KEGG富集分析。(f) 软骨细胞抗氧化和抗炎信号通路相关蛋白的Western blot分析。(g)-(k) 软骨细胞中NRF2、p-P65、P65、p-IκBα和IκBα相对蛋白表达水平的定量分析。所有蛋白水平均归一化至GAPDH。(l)-(n) 不同处理软骨细胞中TNF-α、IL-6和IL-1β相对mRNA表达水平的RT-qPCR分析。

（6）线粒体保护、软骨基质恢复与抗炎活性

为评估线粒体ROS水平，采用MitoSOX探针进行荧光成像。结果显示，PMI或PDM处理后荧光强度略有下降，而PDMI处理组表现出显著的荧光信号降低，表明其在清除线粒体ROS方面具有优越性。JC-1实验显示，H₂O₂暴露的软骨细胞呈现强绿色荧光，提示线粒体损伤和膜电位降低；PDMI处理组显示更强的红色荧光和减弱的绿色信号，表明其对线粒体给予了显著保护。Col2α免疫荧光染色和FCM定量分析表明，PDMI显著恢复了炎症条件下降低的Col2α表达，具有恢复ECM稳态的潜力。在H₂O₂模拟的病理条件下，PDMI有效保持了软骨细胞活力，甚至高于对照组，并显著抑制软骨细胞凋亡。此外，PDMI未顺利获得诱导巨噬细胞凋亡实现抗炎，而是显著促进巨噬细胞向M2表型极化。ELISA结果显示，LPS刺激增加了巨噬细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的产生，PDMI进一步将细胞因子水平抑制至接近对照组，同时显著抑制软骨细胞中MMP-13的表达，表现出对软骨降解的保护作用。

图7. PDMI在炎症微环境功能调控、软骨细胞保护和抗炎方面的表征。(a) MitoSOX检测软骨细胞线粒体超氧化物水平的代表性荧光图像。(b) 相对MitoSOX荧光强度的定量分析。(c) JC-1检测线粒体膜电位的代表性荧光图像，JC-1单体呈绿色，JC-1聚集体呈红色。(d) 基于红绿荧光强度比的线粒体膜电位定量分析。(e) 软骨细胞Col2α表达的代表性免疫荧光图像，Hoechst染核（蓝色），鬼笔环肽染F-actin（品红色），Col2α呈绿色。(f) 相对Col2α荧光强度的定量分析。(g) 软骨细胞Col2α表达水平的代表性FCM图。(h) 软骨细胞Col2α表达水平的统计分析。(i) PDMI处理炎症软骨细胞的CCK-8活力检测。(j) 炎症软骨细胞凋亡率。(k) 与PDMI孵育后巨噬细胞活力的FCM分析。(l) 与PDMI共培养后巨噬细胞凋亡率的流式细胞术检测。(m) 巨噬细胞M2表型极化率。(n) 巨噬细胞M1表型极化率。(o) 巨噬细胞M2/M1表型比值。(p)-(r) 巨噬细胞IL-6、IL-1β和TNF-α表达水平。(s) 软骨细胞MMP-13表达水平。

（7）体内滞留与治疗效果

为评估PDMI的体内关节内滞留能力，将Cy5标记的PDMI注入大鼠膝关节，陆续在21天监测其分布。游离Cy5的荧光在第9天完全消失，而PDMI-Cy5在给药后18天仍保留超过50%的荧光强度。一相指数衰减拟合显示，Cy5标记PDMI的表观关节内滞留半衰期为22.93天，约为游离Cy5（2.58天）的8.9倍。在大鼠PTOA模型（ACLT联合pMMx）中，术后第2天进行单次关节内注射，并辅以每日跑步训练加速PTOA进展。4周后Micro-CT显示，PTOA组出现骨表面粗糙度和骨赘形成增加，而PDMI组骨表面形态更光滑。定量分析表明，PDMI治疗后BV/TV、BS/BV、Tb.Sp、Tb.Th和Tb.N等亚软骨骨微结构参数均向Sham组方向偏移，显著优于PTOA组，表明PDMI减轻了骨赘形成和异常亚软骨骨重塑。

图8. PDMI体内滞留与PTOA治疗效果的表征。(a) 显示PDMI关节内滞留的代表性荧光图像。(b) PDMI关节内滞留辐射效率的统计分析。(c) PTOA模型建立及关节内注射和术后管理的治疗时间线。(d) 治疗4周后不同组的代表性2D Micro-CT和3D重建图像。(e-i) 亚软骨骨微结构参数定量分析，包括BV/TV、BS/BV、Tb.Sp、Tb.Th和Tb.N。

（8）组织学、免疫组化与免疫荧光评价

组织学分析显示，Sham组软骨切线层陆续在完整，软骨细胞纵向排列有序；而PTOA组切线层变薄、软骨膜表面破坏、软骨细胞挤出聚集、潮线粘附破坏。PDMI治疗组软骨组织形态显著改善，接近Sham组，OARSI评分较PTOA组降低超过80%。SO/FG染色显示PTOA组糖胺聚糖（GAG）显著丢失，而PDMI治疗组GAG含量恢复至接近Sham组水平。TB染色进一步支持PDMI的软骨保护效应。炎症评分显示，PMI和PDM分别使炎症降低39.53%和34.88%，而PDMI顺利获得主动-被动协同调节使炎症评分降低74.42%。软骨组织MDA水平在PTOA组显著升高，PDMI处理后降至接近Sham组，表明其减轻了脂质过氧化和氧化损伤。免疫组化显示，PTOA组MMP-13显著升高而Col2α明显降低；PDMI对两者的调节效果最显著，使MMP-13降低、Col2α升高至接近Sham组水平。免疫荧光显示，PTOA组F4/80和iNOS荧光分别增加约16.65倍和16.59倍，而PDMI使F4/80和iNOS荧光面积分别减少约89.64%和51.34%，同时使Arg-1荧光增加约8.10倍，表明PDMI减轻炎症性巨噬细胞浸润并促进其向抗炎修复表型转化。此外，YAP免疫荧光显示PTOA组YAP表达增加约2.53倍，提示关节损伤后机械敏感信号异常激活；PDMI使YAP表达较PTOA组降低约65.47%，表明其顺利获得改善机械微环境缓解异常机械转导激活。

图9. 治疗4周后大鼠膝关节软骨退变、细胞外基质稳态和巨噬细胞反应的组织学、免疫组化和免疫荧光评价。(a) 苏木精-伊红染色、(c) 番红O/固绿染色和(e) 甲苯胺蓝染色的代表性图像。(b) OARSI评分、(d) 相对糖胺聚糖含量和(f) 炎症评分的定量分析。(g) 关节软骨组织MDA水平的代表性免疫组化图像。(h) MMP-13和(j) Col2α表达的代表性免疫组化图像。(i) MMP-13阳性细胞和(k) Col2α阳性细胞的定量分析。(l) F4/80、(n) iNOS、(p) Arg-1和(r) YAP表达的代表性免疫荧光图像。(m) F4/80、(o) iNOS、(q) Arg-1和(s) YAP表达的定量分析。

（9）生物安全性评价

生物安全性是评估生物材料临床应用潜力的关键考量。治疗4周后收集主要器官（心、肝、脾、肺、肾）进行H&E染色病理检查，结果显示各组均未观察到炎症、水肿或坏死等病理异常，表明材料注射未引起全身毒性或器官损伤。此外，全血细胞计数（MCH、MCV、MPV、RBC、WBC、HCT）和血清生化分析（ALT、AST、LDH、CK、UREA、CREA）进一步证实了不存在全身毒性。这些结果共同表明PDMI介导的关节内PTOA治疗具有优异的体内生物相容性和生物安全性。

图10. 体内全身毒性评价。(a) PDMI对大鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的H&E染色生物相容性表征。(b-g) 基于全血细胞计数的生物安全性表征，包括(b)平均红细胞血红蛋白(MCH)、(c)平均红细胞体积(MCV)、(d)平均血小板体积(MPV)、(e)红细胞计数(RBC)、(f)白细胞计数(WBC)和(g)红细胞压积(HCT)。(h-m) 基于血清生化分析的生物安全性表征，包括(h)丙氨酸氨基转移酶(ALT)、(i)天冬氨酸氨基转移酶(AST)、(j)乳酸脱氢酶(LDH)、(k)肌酸激酶(CK)、(l)血尿素氮(UREA)和(m)肌酐(CREA)。